青海發(fā)光桿菌目的基因的敲除采用同源重組的方法。本實驗首先利用谷氨酰胺合成酶基因glnA上下游引物glnA-FW和glnA-RV擴(kuò)增出glnA基因序列，大小為1335 bp。然后將其連接到pMD19-T質(zhì)粒上，構(gòu)建質(zhì)粒pMD19T-glnA。同樣的，利用引物NEO-FW和NEO-RV擴(kuò)增出新霉素抗性基因Neo，并將其連接到pMD19-T載體上，構(gòu)建質(zhì)粒pMD19T-Neo。將質(zhì)粒pMD19T-glnA和pMD19T-Neo均用NcoⅠ和PstⅠ酶進(jìn)行雙酶切，酶切后的新霉素片段連接到經(jīng)同樣酶切的pMD19T-glnA質(zhì)粒上，構(gòu)建敲除質(zhì)粒pMD19T-ΔglnA∷Neo。zui后將敲除質(zhì)粒pMD19T-ΔglnA∷Neo轉(zhuǎn)化進(jìn)入枯草芽孢桿菌WB600中進(jìn)行同源重組，在新霉素平板上篩選正確的轉(zhuǎn)化子。
青海發(fā)光桿菌將重組菌接種于20 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min過夜活化。按照初始OD600 0.1的添加量轉(zhuǎn)接于30 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min培養(yǎng)36 h，期間每隔2 h取樣1次測定菌體濃度，zui后一次取樣間隔為4 h。菌體濃度的測定以分光光度計600 nm波長下的吸光值OD600表示。OD600根據(jù)下列公式轉(zhuǎn)化為細(xì)胞干重：1 OD =0.35 g/L DCW。
Palmitic acid    20mg/支    1957/10/3    棕櫚酸
Phellodendrine chloride    10mg/支    104112-82-5    鹽酸黃柏堿
Magnoflorine iodide    10mg/支    2141/9/5    碘化木蘭花堿
(-)-Syringaresnol-4-O-β-D-apiofuranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside    10mg/支    136997-64-3    (-)-丁香樹脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷
含量測定    20mg    110703-200726    人參皂苷Rgl
含量測定    1ml    110707-201011    水楊酸甲酯
含量測定    0.5ml    110710-201016    桂皮醛
含量測定    20mg    110712-201010    鹽酸水蘇堿
含量測定    20mg    110717-200204    靛玉紅
含量測定    20mg    110718-200507    酯蟾毒配基
含量測定    100mg    110728-200506    薄荷腦
青海發(fā)光桿菌